奶粉中三聚氰胺的測定方法
2008-09-27
[2490]
GC-MS法測定動物食品中的三聚氰胺
Spectra-Quad實現(xiàn)三聚氰胺含量在線檢測
超液相色譜_電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法測定飼料中殘留的三聚氰胺
反相液相色譜法測定飼料中三聚氰胺的含量
液相色譜-二極管陣列法測定高蛋白食品中的三聚氰胺
液相色譜法(HPLC)測定飼料中三聚氰胺的含量
液相色譜-四極桿質(zhì)譜聯(lián)用測定飼料中三聚氰胺含量
固相萃取與液相色譜聯(lián)用測定寵物食品中三聚氰胺
液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MSMS)分析寵物食品中三聚氰胺
液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定飼料中三聚氰胺殘留
GC-MS法測定動物食品中的三聚氰胺
測定方法
本實驗中綜合各方法穩(wěn)定性進(jìn)行比較，主要介紹以下三種：
- 固相萃取（SPE）方法
- HPLC-UV檢測方法
- LC-MS檢測方法（僅供參考）
檢測中所需的儀器與條件
- Agilent1100液相色譜儀(美國，Agilent公司)；二極管陣列檢測器(DAD)，檢測波長240nm，柱溫：
(1)AgelaVenusilTMASBC18(4.6×
(2)AgelaVenusilTMASBC8(4.6×
- 離子交換固相萃取柱AgelaClearnertTMPCX(北京艾杰爾科技有限公司)
混合型的陽離子交換柱(Cleanert PCX 60mg/3mL)50支
- 臺式高速（微量）離心機 TG16-WS/TG16-W (湖南湘儀離心機儀器有限公司)
（1）角轉(zhuǎn)子: 12＊1.5ml；12＊10ml 轉(zhuǎn)速≥8000rpm/min，微機控制可定時；常溫
（2）離心管：10ml.或1.5ml（一套）
- 三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品1瓶(250mg,≥99.5％)
- 三聚氰胺分析方法手冊１份
其他試劑
飼料/奶粉樣品；甲醇、乙腈；氨水、乙酸鉛、三氯乙酸、檸檬酸、庚烷磺酸鈉 、辛烷磺酸鈉(Sigma公司)；甲醇為色譜純，其他均為化學(xué)純。
理化性質(zhì)
三聚氰胺:英文名"melamine",簡稱三胺,學(xué)名三氨三嗪,別名蜜胺、氰尿酰胺、三聚酰胺。分子式：C3N6H6、C3N3(NH2)3:分子量:126.12
物理性能:白色結(jié)晶粉末,無毒,無味;相對密度:
化學(xué)性能：三聚氰胺是一種重要的氮雜環(huán)有機化工原料，顯弱堿性，能夠與各種酸反應(yīng)生成三聚酸二酰胺鹽；在強酸或強堿液中，三聚氰胺發(fā)生水解，胺基逐步被羥基取代，處成三聚氰酸二酰胺、三聚握酸一酰胺和三聚氰酸；三聚握胺與醛類反應(yīng)生成加成化合物；三聚氰胺與甲醛反應(yīng)制成樹脂，三聚氰胺樹脂，三聚氰樹脂是一種多種用途的材料，防水耐熱且有很高的穩(wěn)定性，用于生產(chǎn)塑料、地板磚，廚房用具，防炎纖維，商業(yè)濾膜，膠水和阻燃劑。
1 固相萃?。?/span>SPE）柱的選擇：
三聚氰胺呈弱堿性（弱陽離子化合物），凈化過程一般選擇陽離子交換柱?；旌闲偷年栯x子交換柱（PCX）通過將磺酸基因（-SO3H）鍵何在極性高聚物聚苯乙烯/二乙烯苯（PEP）吸附劑上，具有陽離子和反相兩種吸附機理，并具有以下優(yōu)點：
1) 可通過兩種不同溶液的洗滌（水/一定pH值的緩沖溶液和有機溶劑），使樣品更干凈，提高檢測的靈敏度。
2) 批次重復(fù)性好。
3) 回收率高，重現(xiàn)性好，即使小柱跑干也可以得到較高回收率。
信息來源：www.xiangyilxj.com
圖 PCX結(jié)構(gòu)式
2 樣品前處理步驟：
2.1 標(biāo)準(zhǔn)樣品配制：
取50mg三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品，以20%甲醇溶解定容至50ml得到1000ppm的標(biāo)準(zhǔn)溶液，使用時，以提取液（1%三氯乙酸）稀釋至所要的濃度。
2.2 提取
稱取飼料/奶粉樣品
2.3 凈化（PCX小柱，60ml/3ml）：
1） 活化及平衡： 3ml甲醇 ，3ml 水
2） 上樣：加入提取液 3ml
3） 淋洗：3ml 水；3ml甲醇：棄去淋洗液并將小柱抽干。
4） 洗脫：5ml 5%氨化甲醇（v/v）洗脫。（5%氨化甲醇的配制：5ml氨水+95ml甲醇）。
5) 濃縮：
HPLC-UV檢測方法
三聚氰胺在傳統(tǒng)的C18柱上保留很差，需要用離子對試劑色譜方法才能有良好的保留與分離，按照美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）的三聚氰胺檢測方法和中國農(nóng)業(yè)部頒部的三聚氰胺檢測方法，采用Venusi ASB系列親水色譜柱，均能得到良好的結(jié)果，分析色譜圖如下：
1、 三聚氰胺的FDA檢測方法
色譜柱：Venusil ASB C8 4.6×250mm
緩沖液：10mM辛烷磺酸鈉，調(diào)Ph為3.0
流動相：緩沖液：乙腈=85：15
進(jìn)樣量：樣品用緩沖液溶解成約0.1mg/mL,進(jìn)10uL
流 速：1.0Ml/min
柱 溫：40 °C
波 長：240nm
2、三聚氰胺的中國農(nóng)業(yè)部頒標(biāo)準(zhǔn)檢測方法
色譜柱：Venusil ASB-C8 4.6×250mm
緩沖液：10mM檸檬酸，10mM庚烷磺酸鈉
流動相：緩沖溶液：乙腈=85：15
進(jìn)樣量：樣品用緩沖液溶解成約0.1mg/mL,進(jìn)10uL
流 速：1.0Ml/min
柱 溫：40°C
波 長：240nm
表1 PCX柱回收率
| 添加水平（mg/L） | 回收率 |
| 空白 | |
| 0.01 | 116% |
| 0.1 | 108% |
| 0.5 | 92% |
| 2 | 96% |
由上表1可以看出：用PCX柱凈化樣品，可以得到滿意的回收率，此方法處理樣品，比FDA公布的前處理方法更加準(zhǔn)確、可靠。
LC-MS參考方法
由于FDA公布的HPLC-UV方法中，流動相添加了離子對試劑，限制了液質(zhì)聯(lián)用方法的使用；但不用離子對試劑色譜方法，三聚氰胺在傳統(tǒng)的C18柱上保留很差，沒有良好的保留與分離。 源于此問題采用Venusil ASB系列親水色譜柱，不用離子對試劑也能得到有效的保留與分離，參考方法如下：
緩沖液：10mM NH4AC
流動相：緩沖液：ACN=95： 5
進(jìn)樣量：先用70%ACN溶解成約1mg/mL,用CAN稀釋成1.0mg/mL,進(jìn)10uL
柱 溫：40°C
波 長：240nm
與FDA2007年4月公布的《UpdatedFCCDevelopmentalMelamineQuantitation(HPLC-UV)》相比較，該方法大大降低了zui低檢測限(MSD：0.5ppm；UV：2ppm)，提高了檢測靈敏度。
結(jié)果與討論
陽離子交換柱(PCX)
三聚氰胺呈弱堿性(弱陽離子化合物)，凈化過程一般應(yīng)選擇陽離子交換柱。混合型的陽離子交換柱(PCX)通過將磺酸基團(-SO3H)鍵合在極性高聚物聚苯乙烯/二乙烯苯(PEP)吸附劑上，具有陽離子交換和反相吸附兩種機理，并具有以下優(yōu)點：
a)可通過兩種不同溶液的洗滌(水/一定pH值的緩沖溶液和有機溶劑)，使樣品更干凈，提高檢測的靈敏度。
b)批次重復(fù)性好。
c)回收率高，重現(xiàn)性好，即使小柱跑干也可以得到較高回收率。
國家食品質(zhì)量監(jiān)督檢測中心有關(guān)人士稱，在現(xiàn)有的國家標(biāo)準(zhǔn)奶粉檢測中，主要進(jìn)行蛋白質(zhì)、脂肪、細(xì)菌等檢測。三聚氰胺屬于化工原料，是不允許添加到食品中的，所以現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)不會包含相應(yīng)內(nèi)容。也就是說，三聚氰胺不屬于常規(guī)檢測項目，正常情況下，很少有人會想到去檢測它。
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